Juana werd op 28 februari 1462 in Madrid geboren als Juana de Castilie als dochter van koningin Juana de Portugal en Enrique IV. Ze kreeg haar bijnaam Beltraneja omdat er twijfels waren over haar afkomst. En deel van de adel, waaronder Juan Pacheco, stelde dat Beltran de la Cueva en niet koning Enrique haar vader was.

Ze werd op 9 mei 1462 tot princesa van Asturias en erfgenaam van de troon benoemd in de Iglesia de San Pedro el Viejo in Madrid. Later zou ze om reden van haar afkomst haar titel van prinses van Asturias en daardoor ook van het erfgenaamschap van de troon moeten afzien ten gunste van Isabel.

Na de dood van haar vader, Enrique IV, riep haar tante, Isabel, zich uit tot koningin en brak er een burgeroorlog uit, de zogenoemde successieoorlog, waarbij de, onbesliste, slag om Toro een van de belangrijkste confrontaties was.

Na het verliezen van de oorlog leefde ze in verbanning in Portugal, waar ze “a Excelente Senhora” werd genoemd.

Overleed op 12 april 1530 in Lissabon.

.