Juana nació el 28 de febrero 1462 en Madrid como Juana de Castilla, hija de la reina Juana de Portugal y el rey Enrique IV. Recibió el apodo de Beltraneja porque había dudas sobre su ascendencia. Una parte de la nobleza, incluido Juan Pacheco, sugirió que Beltrán de la Cueva y no el rey Enrique era su padre.

Fue nombrada princesa de Asturias y heredera del trono el 9 de mayo de 1462 en la Iglesia de San Pedro el Viejo en Madrid. Más tarde, debido a su ascendencia, tendría que renunciar a su título de princesa de Asturias y, por lo tanto, a su derecho a la sucesión al trono en favor de Isabel.

Después de la muerte de su padre, Enrique IV, su tía, Isabel, se proclamó reina y estalló una guerra civil, la llamada guerra de sucesión, en la que la batalla indecisa de Toro fue una de las confrontaciones más importantes.

Después de perder la guerra, vivió en el exilio en Portugal, donde fue llamada ‘a Excelente Senhora’.

Falleció el 12 de abril de 1530 en Lisboa.